Одна из наиболее актуальных задач аналитической биотехнологии – создание простых биосенсорных устройств, которые позволяют осуществлять экспресс-анализ физиологически важных соединений в различных биологических жидкостях. Самое популярное решение в этом направлении – иммунохимический экспресс-метод на основе латерального проточного иммуноанализа (ЛПИА). Вашему вниманию – информация о том, как работает метод, какими преимуществами обладает и какие его виды наиболее эффективны.
Основной задачей метода ЛПИА является высокочувствительный полуколичественный иммуноанализ физиологически сложных соединений. Результатом анализа является появление окраски в тестовой зоне, интенсивность которой зависит от концентрации анализируемого вещества.
Основные преимущества метода ЛПИА:
- Простота в использовании: все необходимые для проведения анализа специфические компоненты уже содержатся в тест-системе (для анализа требуется всего лишь добавить несколько капель образца)
- Короткое время проведения анализа: как правило, 5-10 минут
- Возможность визуальной интерпретации результата анализа – по интенсивности окрашивания тестовой зоны или с помощью специальных портативных детектирующих устройств
Широкое распространение на практике метод ЛПИА получил в медицинской диагностике. Однако в последние годы большое внимание уделяется разработке таких аналитических экспресс-методов для целей пищевой промышленности и ветеринарной диагностики.
Виды ЛПИА
Наиболее распространены:
- Латеральный проточный иммуноанализ с коллоидным золотом
- Латеральный проточный иммуноанализ с ферментной меткой
Рассмотрим эти два метода детальнее и определим их преимущества и недостатки.
Метод латерального проточного иммуноанализа с коллоидным золотом
В данном методе в качестве метки используется коллоидное золото.
Растворы коллоидного золота с заданным размером частиц получают по методу Френса путем восстановления в водном растворе золотохлористоводной кислоты цитратом натрия.
Как работает метод?
Коллоидное золото образует с антителом конъюгат, который в свою очередь связывается с антигенами (антибиотиками), если такие имеются. Конъюгат может размещаться непосредственно на аналитической полоске или попадать туда уже с биологической жидкостью (в зависимости от типа тест-полосок).
Движение потока происходит от основания аналитической полоски вверх по рабочей мембране к тестовой и контрольной зоне: тут происходит связывание комплекса «антиген-конъюгат» с центрами связывания специфических антигенов. Реакция односторонняя, потому как движение потока происходит только в одном направлении.
Недостаток состоит в том, что комплекс «антиген-конъюгат» имеет только один шанс связаться в тестовой зоне.
| На чувствительность реакции влияет скорость движения потока биологического образца по рабочей мембране. |
Выбор тест-полосок: на что обратить внимание
Выбор полосок для аналитического метода, основанного на проведении реакции в латеральном потоке жидкости в мембране, является одним из ключевых моментов.
Рис. 1 . Аналитическая полоска
В тестах используют различные виды коммерческих полосок. При выборе оптимальной аналитической полоски рассматриваются такие параметры:
- Средний размер пор
- Степень связывания белков
- Способность пропускать цельное молоко
Данные характеристики оказывают значительное влияние на протекание анализа. Например, при увеличении размера пор увеличивается скорость потока жидкости в мембране, соответственно уменьшается время анализа. Но при этом наблюдается заметное размывание тестовой и контрольных линий, что затрудняет визуальную детекцию результата.
Цельное молоко имеет сложный состав, который варьируется от животного к животному (в частности, жирность). Вариабельность исследуемых образцов может оказывать большое влияние на проведение анализа и как следствие – на определение анализируемого вещества. Так, гетерогенный состав может затруднять протекание образца по мембранам, что создает дополнительные трудности при работе с реальными образцами.
При выборе полоски особое внимание следует обратить на мембрану: она должна обеспечивать равномерное протекание образца по тест-полоске. При удачном подборе качественных компонентов экспресс-тесты будут показывать точные результаты. И наоборот: при использовании менее качественных компонентов возрастает процент сомнительных и ложных реакций.
Метод латерального проточного иммуноанализа с ферментной меткой
Стоит отметить, что использование коллоидного золота в качестве метки не всегда может удовлетворить требование к низким пределам обнаружения, которые регламентируются соответствующими государственными органами. В связи с этим для повышения чувствительности возникает потребность в дополнительном оборудовании, которое будет создавать специальные температурные условия – инкубатор. Необходимость использования инкубатора для проведения экспресс-тестов делает их более «лабораторными» и вызывающими сложности при использовании в нелабораторных условиях.
Поэтому для быстрого, с более низкими пределами обнаружения и увеличенным количеством определяемых антибиотиков был разработан другой метод – латеральный проточный иммуноанализ с ферментной меткой.
В качестве метки использовали пероксидазу хрена. В тестовой зоне сорбировали специфические антитела, а в контрольной зоне – антитела к пероксидазе хрена.
При проведении анализа биологическую жидкость смешивают с конъюгатом (комплексом антитела и пероксидазой хрена), который связывается с антителами (если такие имеются). Образованный комплекс переносят на аналитическую тест-полоску.
Рис. 2. Связь антибиотика и конъюгата
| Метод иммуноанализа с ферментной меткой имеет преимущество перед иммуноанализом с коллоидным золотом, потому что позволяет проводить двустороннюю реакцию. |
Рис. 3. Связь комплекса «антиген-конъюгат» в тестовой зоне
Как работает метод?
Такой метод позволяет комплексу «антиген-конъюгат» получить второй шанс связаться в тестовой зоне, что увеличивает точность и достоверность результата (рис. 2, рис. 3, рис. 4).
Рис. 4. Направление движения латерального потока к тестовой зоне
При переносе комплекса биологической жидкости и конъюгата на аналитическую полоску происходит движение потока от основания аналитической полоски по рабочей мембране к тестовой и контрольной зоне. Тут происходит связывание комплекса «антиген-конъюгат» с центрами связывания специфических антител (рис. 5). После чего запускается второй этап реакции: по аналитической полоске в обратном направлении начинает движение бесцветный субстрат, который перед собой активизирует движение комплекса «антиген-конъюгат» в обратном направлении (позволяет ему получить повторный шанс для связывания в тестовой зоне). Движущийся поток бесцветного субстрата взаимодействует с ферментом коньюгата в тестовой зоне аналитической полоски, что приводит к изменению окраса в тестовой зоне.
Рис. 5. Связанные комплексы «антиген-конъюгат» с центрами связывания специфических антител
Аналитические мембраны
Данный метод использует универсальные мембранные компоненты. Они позволяют проводить анализ не только цельного молока, но и восстановленного из сухого порошка, пастеризованного, стерилизованного, обезжиренного и даже смешанного от разных видов животных.
Благодаря использованию пероксидазы хрена стало возможным:
- Увеличить количество определяемых антигенов
- Сократить время анализа до 6 минут
- Понизить пределы обнаружения без использования дополнительного оборудования
Именно такой метод использует компания IDEXX lab. в своих тестах линейки SNAP для определения остаточных антибиотиков в молоке.
| Экспресс-тесты для определения антибиотиков в молоке – со склада HLR. |
Рис.6. Зворотній рух комплексу «антиген-кон’югат»
| Отсутствие необходимости использовать инкубатор делает метод латерального проточного иммуноанализа с ферментной меткой универсальным для применения в нелабораторных условиях. |
Основными преимуществами тест-систем является быстрота проведения анализа и высокая чувствительность. Метод латерального проточного иммуноанализа работает в широком диапазоне концентрации. Поэтому его применение предпочтительно для полуколичественного анализа по принципу «да-нет».
Сравнительный анализ: выводы
Проведенный анализ демонстрирует значительные преимущества метода латерального проточного иммуноанализа с ферментной меткой.
Тест-системы, которые работают по этому принципу:
- Показывают высокую эффективность при определении наличия антибиотиков в молоке
- Благодаря возможности проводить двустороннюю реакцию увеличивают точность и достоверность результатов
- Исключают необходимость длительной пробоподготовки образцов и наличия сложного лабораторного оборудования
Андрей Липкань,
специалист отраслевой группы «Пищевая промышленность»
ТОВ «ХИМЛАБОРРЕАКТИВ»