Экспресс-методы иммуноанализа в молоке

Одна из наиболее актуальных задач аналитической биотехнологии – создание простых биосенсорных устройств, которые позволяют осуществлять экспресс-анализ физиологически важных соединений в различных биологических жидкостях. Самое популярное решение в этом направлении – иммунохимический экспресс-метод на основе латерального проточного иммуноанализа (ЛПИА). Вашему вниманию – информация о том, как работает метод, какими преимуществами обладает и какие его виды наиболее эффективны.

Основной задачей метода ЛПИА является высокочувствительный полуколичественный иммуноанализ физиологически сложных соединений. Результатом анализа является появление окраски в тестовой зоне, интенсивность которой зависит от концентрации анализируемого вещества.

Основные преимущества метода ЛПИА:

  • Простота в использовании: все необходимые для проведения анализа специфические компоненты уже содержатся в тест-системе (для анализа требуется всего лишь добавить несколько капель образца)
  • Короткое время проведения анализа: как правило, 5-10 минут
  • Возможность визуальной интерпретации результата анализа – по интенсивности окрашивания тестовой зоны или с помощью специальных портативных детектирующих устройств

Широкое распространение на практике метод ЛПИА получил в медицинской диагностике. Однако в последние годы большое внимание уделяется разработке таких аналитических экспресс-методов для целей пищевой промышленности и ветеринарной диагностики.

Виды ЛПИА       

Наиболее распространены:

  • Латеральный проточный иммуноанализ с коллоидным золотом
  • Латеральный проточный иммуноанализ с ферментной меткой

            Рассмотрим эти два метода детальнее и определим их преимущества и недостатки.

Метод латерального проточного иммуноанализа с коллоидным золотом

В данном методе в качестве метки используется коллоидное золото.

Растворы коллоидного золота с заданным размером частиц получают по методу Френса путем восстановления в водном растворе золотохлористоводной кислоты цитратом натрия.

Как работает метод?

Коллоидное золото образует с антителом конъюгат, который в свою очередь связывается с антигенами (антибиотиками), если такие имеются. Конъюгат  может размещаться непосредственно на аналитической полоске или попадать туда уже с биологической жидкостью (в зависимости от типа тест-полосок).

Движение потока происходит от основания аналитической полоски вверх по рабочей мембране к тестовой и контрольной зоне: тут происходит связывание комплекса «антиген-конъюгат» с центрами связывания специфических антигенов. Реакция односторонняя, потому как движение потока происходит только в одном направлении.

Недостаток состоит в том, что комплекс «антиген-конъюгат» имеет только один шанс связаться в тестовой зоне. 

На чувствительность реакции влияет скорость движения потока биологического образца по рабочей мембране.

Выбор тест-полосок: на что обратить внимание

Выбор полосок для аналитического метода, основанного на проведении реакции в латеральном потоке жидкости в мембране, является одним из ключевых моментов.

Рис. 1 . Аналитическая полоска

В тестах используют различные виды коммерческих полосок. При выборе оптимальной аналитической полоски рассматриваются такие параметры:

  • Средний размер пор
  • Степень связывания белков
  • Способность пропускать цельное молоко

 Данные характеристики оказывают значительное влияние на протекание анализа. Например, при увеличении размера пор увеличивается скорость потока жидкости в мембране, соответственно уменьшается время анализа. Но при этом наблюдается заметное размывание тестовой и контрольных линий, что затрудняет визуальную детекцию результата.

Цельное молоко имеет сложный состав, который варьируется от животного к животному (в частности, жирность). Вариабельность исследуемых образцов может оказывать большое влияние на проведение анализа и как следствие – на определение анализируемого вещества. Так, гетерогенный состав может затруднять протекание образца по мембранам, что создает дополнительные трудности при работе с реальными образцами.

При выборе полоски особое внимание следует обратить на мембрану: она должна обеспечивать равномерное протекание образца по тест-полоске. При удачном подборе качественных компонентов экспресс-тесты будут показывать точные результаты. И наоборот: при использовании менее качественных компонентов возрастает процент сомнительных и ложных реакций.

Метод латерального проточного иммуноанализа с ферментной меткой

Стоит отметить, что использование коллоидного золота в качестве метки не всегда может удовлетворить требование к низким пределам обнаружения, которые регламентируются  соответствующими государственными органами. В связи с этим для повышения чувствительности возникает потребность в дополнительном оборудовании, которое будет создавать специальные температурные условия – инкубатор. Необходимость использования инкубатора для проведения экспресс-тестов делает их более «лабораторными» и вызывающими сложности при использовании в нелабораторных условиях.

Поэтому для быстрого, с более низкими пределами обнаружения и увеличенным количеством определяемых антибиотиков был разработан другой метод – латеральный проточный иммуноанализ с ферментной меткой.

В качестве метки использовали пероксидазу хрена. В тестовой зоне сорбировали специфические антитела, а в контрольной зоне – антитела к пероксидазе хрена.

При проведении анализа биологическую жидкость смешивают с конъюгатом (комплексом антитела и пероксидазой хрена), который связывается с антителами (если такие имеются). Образованный комплекс переносят на аналитическую тест-полоску.

Рис. 2. Связь антибиотика и конъюгата

Метод иммуноанализа с ферментной меткой имеет преимущество перед иммуноанализом с коллоидным золотом, потому что позволяет проводить двустороннюю реакцию.

Рис. 3. Связь комплекса «антиген-конъюгат» в тестовой зоне

Как работает метод?

Такой метод позволяет комплексу «антиген-конъюгат» получить второй шанс связаться в тестовой зоне, что увеличивает точность и достоверность результата (рис. 2, рис. 3, рис. 4).

Рис. 4. Направление движения латерального потока к тестовой зоне

При переносе комплекса биологической жидкости и конъюгата на аналитическую полоску происходит движение потока от основания аналитической полоски по рабочей мембране к тестовой и контрольной зоне. Тут происходит связывание комплекса «антиген-конъюгат» с центрами связывания специфических антител (рис. 5). После чего запускается второй этап реакции: по аналитической полоске в обратном направлении начинает движение бесцветный субстрат, который перед собой активизирует движение комплекса «антиген-конъюгат» в обратном направлении (позволяет ему получить повторный шанс для связывания в тестовой зоне). Движущийся поток бесцветного субстрата взаимодействует с ферментом коньюгата в тестовой зоне аналитической полоски, что приводит к изменению окраса в тестовой зоне.  

Рис. 5. Связанные комплексы «антиген-конъюгат» с центрами связывания специфических антител

Аналитические мембраны

Данный метод использует универсальные мембранные компоненты. Они позволяют проводить анализ не только цельного молока, но и восстановленного из сухого порошка, пастеризованного, стерилизованного, обезжиренного и даже смешанного от разных видов животных.

Благодаря использованию пероксидазы хрена стало возможным:

  • Увеличить количество определяемых антигенов
  • Сократить время анализа до 6 минут
  • Понизить пределы обнаружения без использования дополнительного оборудования

Именно такой метод использует компания IDEXX lab. в своих тестах линейки SNAP для определения остаточных антибиотиков в молоке.

Экспресс-тесты для определения антибиотиков в молоке – со склада HLR.

Рис. 6. Обратное движение комплекса «антиген-конъюгат»

Отсутствие необходимости использовать инкубатор делает метод латерального проточного иммуноанализа с ферментной меткой универсальным для применения в нелабораторных условиях.

 Основными преимуществами тест-систем является быстрота проведения анализа и высокая чувствительность. Метод латерального проточного иммуноанализа работает в широком диапазоне концентрации. Поэтому его применение предпочтительно для полуколичественного анализа по принципу «да-нет».

Сравнительный анализ: выводы

Проведенный анализ демонстрирует значительные преимущества метода латерального проточного иммуноанализа с ферментной меткой.

Тест-системы, которые работают по этому принципу:

  • Показывают высокую эффективность при определении наличия антибиотиков в молоке
  • Благодаря возможности проводить двустороннюю реакцию увеличивают точность и достоверность результатов
  • Исключают необходимость длительной пробоподготовки образцов и наличия сложного лабораторного оборудования

Андрей Липкань,

специалист отраслевой группы «Пищевая промышленность»

ТОВ «ХИМЛАБОРРЕАКТИВ»

Добавить комментарии: